Osteoartróza (OA) je jedno z dlhodobých chronických degeneratívnych ochorení kostí a kĺbov, ktoré postihuje populáciu nad 65 rokov [
1]. Pacientom s osteoartritídou sa vo všeobecnosti diagnostikuje poškodená chrupavka, zapálená synoviálna membrána a erodované chondrocyty, ktoré spôsobujú bolesť a fyzické ťažkosti [
2]. Artritická bolesť je prevažne spôsobená degeneráciou chrupavky v kĺboch zápalom a keď je chrupavka vážne poškodená, kosti sa môžu navzájom zrážať, čo spôsobuje neznesiteľnú bolesť a fyzické ťažkosti [
3]. Zapojenie zápalových mediátorov do symptómov, ako je bolesť, opuch a stuhnutosť kĺbu, je dobre zdokumentované. U pacientov s osteoartritídou sa v synoviálnej tekutine nachádzajú zápalové cytokíny, ktoré spôsobujú eróziu chrupavky a subchondrálnej kosti [
4]. Dve hlavné sťažnosti, ktoré pacienti s osteoartritídou zvyčajne majú, sú bolesť a zápal synoviálnej membrány. Preto sú hlavnými cieľmi súčasných terapií osteoartritídy zmiernenie bolesti a zápalu. [
5Hoci dostupné liečby osteoartrózy, vrátane nesteroidných a steroidných liekov, preukázali účinnosť pri zmierňovaní bolesti a zápalu, dlhodobé užívanie týchto liekov má závažné zdravotné následky, ako sú kardiovaskulárne, gastrointestinálne a renálne dysfunkcie [
6]. Preto je potrebné vyvinúť účinnejší liek s menším počtom vedľajších účinkov na liečbu osteoartrózy.
Prírodné produkty pre zdravie sú čoraz populárnejšie, pretože sú bezpečné a ľahko dostupné [
7Tradičné kórejské lieky preukázali účinnosť proti niekoľkým zápalovým ochoreniam vrátane artritídy [
8]. Aucklandia lappa DC. je známa svojimi liečivými vlastnosťami, ako je zlepšenie cirkulácie čchi na zmiernenie bolesti a upokojenie žalúdka, a tradične sa používa ako prírodné analgetikum [
9]. Predchádzajúce správy naznačujú, že A. lappa má protizápalové účinky [
10,
11], analgetikum [
12], protirakovinové [
13] a gastroprotektívne [
14] účinky. Rôzne biologické aktivity A. lappa sú spôsobené jej hlavnými účinnými látkami: kostunolidom, dehydrocostus laktónom, dihydrokostunolidom, kostuslaktónom, α-kostolom, saussurea laktónom a kostuslaktónom [
15]. Skoršie štúdie tvrdia, že kostunolid vykazoval protizápalové vlastnosti v lipopolysacharide (LPS), ktorý indukoval makrofágy reguláciou dráhy NF-kB a proteínu tepelného šoku [
16,
17Žiadna štúdia však neskúmala potenciálne účinky A. lappa pri liečbe osteoartrózy. Súčasný výskum skúmal terapeutické účinky A. lappa proti osteoartróze s použitím modelov MIA indukovanej (monosodnou soľou jodoacetátu) a kyselinou octovou u hlodavcov.
Jodoacetát sodný (MIA) je známy tým, že sa používa na vyvolanie mnohých prejavov bolesti a patofyziologických znakov osteoartrózy u zvierat [
18,
19,
20]. Po injekčnom podaní do kolenných kĺbov MIA narúša metabolizmus chondrocytov a vyvoláva zápal a zápalové príznaky, ako je erózia chrupavky a subchondrálnej kosti, čo sú hlavné príznaky osteoartrózy [
18]. Zvíjavá reakcia vyvolaná kyselinou octovou sa všeobecne považuje za simuláciu periférnej bolesti u zvierat, kde je možné kvantitatívne merať zápalovú bolesť [
19]. Bunková línia myšieho makrofágu RAW264.7 sa bežne používa na štúdium bunkových reakcií na zápal. Po aktivácii LPS makrofágy RAW264 aktivujú zápalové dráhy a vylučujú niekoľko zápalových intermediátorov, ako napríklad TNF-α, COX-2, IL-1β, iNOS a IL-6 [
20Táto štúdia hodnotila antinociceptívne a protizápalové účinky A. lappa proti osteoartritíde v zvieracom modeli MIA, zvieracom modeli indukovanej kyselinou octovou a v bunkách RAW264.7 aktivovaných LPS.
2. Materiály a metódy
2.1. Rastlinný materiál
Sušený koreň A. lappa DC. použitý v experimente bol získaný od spoločnosti Epulip Pharmaceutical Co., Ltd. (Soul, Kórea). Identifikoval ho prof. Donghun Lee z Katedry bylinnej farmakológie, Kolegia kórejskej medicíny, Univerzita Gachon, a číslo poukážky na vzorku bolo uložené ako 18060301.
2.2. HPLC analýza extraktu z A. lappa
A. lappa sa extrahovala pomocou refluxného prístroja (destilovaná voda, 3 hodiny pri 100 °C). Extrahovaný roztok sa prefiltroval a kondenzoval pomocou nízkotlakového odparovača. Extrakt z A. lappa mal výťažok 44,69 % po lyofilizácii pri teplote -80 °C. Chromatografická analýza A. lappa sa uskutočnila pomocou HPLC pripojeného k HPLC systému 1260 Infinity II (Agilent, Pal Alto, CA, USA). Na chromatickú separáciu sa použila kolóna EclipseXDB C18 (4,6 × 250 mm, 5 µm, Agilent) pri teplote 35 °C. Celkovo 100 mg vzorky sa zriedilo v 10 ml 50 % metanolu a sonikovalo sa 10 minút. Vzorky sa prefiltrovali cez striekačkový filter (Waters Corp., Milford, MA, USA) s veľkosťou pórov 0,45 μm. Zloženie mobilnej fázy bolo 0,1 % kyseliny fosforečnej (A) a acetonitrilu (B) a kolóna bola eluovaná nasledovne: 0 – 60 min, 0 %; 60 – 65 min, 100 %; 65 – 67 min, 100 %; 67 – 72 min, 0 % rozpúšťadla B s prietokom 1,0 ml/min. Výtok bol pozorovaný pri 210 nm s použitím injekčného objemu 10 μl. Analýza bola vykonaná v troch opakovaniach.
2.3. Ustajnenie a manažment zvierat
Samce potkanov kmeňa Sprague–Dawley (SD) vo veku 5 týždňov a samce myší ICR vo veku 6 týždňov boli zakúpené od spoločnosti Samtako Bio Korea (Gyeonggi-do, Kórea). Zvieratá boli chované v miestnosti s konštantnou teplotou (22 ± 2 °C) a vlhkosťou (55 ± 10 %) a cyklom svetlo/tma 12/12 hodín. Zvieratá boli s podmienkami oboznamované viac ako týždeň pred začiatkom experimentu. Zvieratá mali k dispozícii krmivo a vodu ad libitum. Pri všetkých experimentálnych postupoch na zvieratách boli prísne dodržiavané súčasné etické pravidlá pre starostlivosť o zvieratá a manipuláciu so zvieratami na Univerzite Gachon (GIACUC-R2019003). Štúdia bola navrhnutá ako zaslepená a paralelná štúdia pre výskumníka. Metódu eutanázie sme dodržali podľa pokynov Etickej komisie pre experimenty na zvieratách.
2.4. Injekcia a liečba MIA
Potkany boli náhodne rozdelené do 4 skupín, a to simulovaná skupina, kontrolná skupina, indometacín a A. lappa. Potkanom bolo po anestezácii 2% zmesou izofluorán O2 injekčne podaných 50 μL MIA (40 mg/m2; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) intraartikulárne do kolenných kĺbov, aby sa vyvolala experimentálna osteoartritída. Liečba bola vykonaná nasledovne: kontrolná a simulovaná skupina boli udržiavané iba na základnej diéte AIN-93G. Skupina s indometacínom dostávala indometacín (3 mg/kg) začlenený do diéty AIN-93G a skupina s A. lappa 300 mg/kg bola zaradená do diéty AIN-93G doplnenej o A. lappa (300 mg/kg). Liečba pokračovala 24 dní od dňa indukcie osteoartritídy v dávke 15 – 17 g na 190 – 210 g telesnej hmotnosti denne.
2.5. Meranie zaťaženia
Po indukcii osteoartrózy sa podľa plánu zmerala nosnosť zadných končatín potkanov pomocou prístroja na meranie kapacity zadných končatín (Incapacitance-MeterTester600, IITC Life Science, Woodland Hills, CA, USA). Vypočítalo sa rozloženie hmotnosti na zadných končatinách: nosnosť (%)
