Osteoartróza (OA) je jedným z dlhodobých chronických degeneratívnych ochorení kostného kĺbu, ktoré postihuje ľudí vo veku nad 65 rokov.
1]. Vo všeobecnosti je u pacientov s OA diagnostikovaná poškodená chrupavka, zapálená synovia a erodované chondrocyty, čo spôsobuje bolesť a fyzické utrpenie.
2]. Artritická bolesť je spôsobená prevažne degeneráciou chrupky v kĺboch zápalom, a keď je chrupavka vážne poškodená, kosti sa môžu navzájom zraziť a spôsobiť neznesiteľnú bolesť a fyzické ťažkosti [
3]. Zapojenie zápalových mediátorov so symptómami, ako je bolesť, opuch a stuhnutosť kĺbu, je dobre zdokumentované. U pacientov s OA sa v synoviálnej tekutine nachádzajú zápalové cytokíny, ktoré spôsobujú eróziu chrupavky a subchondrálnej kosti [
4]. Dve hlavné sťažnosti, ktoré majú pacienti s OA vo všeobecnosti, sú bolesť a synoviálny zápal. Primárnym cieľom súčasných terapií OA je preto zníženie bolesti a zápalu. [
5]. Hoci dostupné liečby OA, vrátane nesteroidných a steroidných liekov, preukázali svoju účinnosť pri zmierňovaní bolesti a zápalu, dlhodobé užívanie týchto liekov má vážne zdravotné následky, ako sú kardiovaskulárne, gastrointestinálne a renálne dysfunkcie.
6]. Na liečbu osteoartritídy sa teda musí vyvinúť účinnejší liek s menším počtom vedľajších účinkov.
Prírodné zdravotné produkty sú čoraz populárnejšie, pretože sú bezpečné a ľahko dostupné [
7]. Tradičné kórejské lieky preukázali účinnosť proti niekoľkým zápalovým ochoreniam vrátane artritídy [
8]. Aucklandia lappa DC. je známy svojimi liečivými vlastnosťami, ako je zvýšenie cirkulácie qi na zmiernenie bolesti a upokojenie žalúdka, a tradične sa používa ako prírodné analgetikum [
9]. Predchádzajúce správy naznačujú, že A. lappa má protizápalové [
10,
11], analgetikum [
12], protirakovinové [
13] a gastroprotektívne [
14] efekty. Rôzne biologické aktivity A. lappa sú spôsobené jeho hlavnými aktívnymi zlúčeninami: costunolid, dehydrocostus laktón, dihydrocostunolid, costuslaktón, α-costol, saussurea laktón a costuslaktón [
15]. Skoršie štúdie tvrdia, že costunolid preukázal protizápalové vlastnosti v lipopolysacharide (LPS), ktorý indukoval makrofágy prostredníctvom regulácie NF-kB a proteínovej dráhy tepelného šoku.
16,
17]. Žiadna štúdia však neskúmala potenciálne aktivity A. lappa pri liečbe OA. Súčasný výskum skúmal terapeutické účinky A. lappa proti OA pomocou (jódoctan sodný) MIA a modelov hlodavcov indukovaných kyselinou octovou.
Jodoacetát monosodný (MIA) sa bežne používa na vyvolanie mnohých bolestivých prejavov a patofyziologických znakov OA u zvierat.
18,
19,
20]. Pri injekcii do kolenných kĺbov MIA narúša metabolizmus chondrocytov a vyvoláva zápal a zápalové symptómy, ako je erózia chrupavky a subchondrálnej kosti, hlavné symptómy OA [
18]. Reakcia zvíjania vyvolaná kyselinou octovou sa všeobecne považuje za simuláciu periférnej bolesti u zvierat, kde je možné kvantitatívne merať zápalovú bolesť.
19]. Myšia makrofágová bunková línia, RAW264.7, sa bežne používa na štúdium bunkových reakcií na zápal. Po aktivácii pomocou LPS makrofágy RAW264 aktivujú zápalové dráhy a vylučujú niekoľko zápalových medzičlánkov, ako sú TNF-α, COX-2, IL-1β, iNOS a IL-6 [
20]. Táto štúdia hodnotila antinociceptívne a protizápalové účinky A. lappa proti OA na zvieracom modeli MIA, na zvieracom modeli indukovanom kyselinou octovou a bunkách RAW264.7 aktivovaných LPS.
2. Materiály a metódy
2.1. Rastlinný materiál
Sušený koreň A. lappa DC. použitý v experimente bol získaný od Epulip Pharmaceutical Co., Ltd., (Soul, Kórea). Identifikoval ho prof. Donghun Lee, Katedra bylinnej farmakológie, plukovník kórejskej medicíny, Univerzita Gachon, a číslo kupónu bolo uložené ako 18060301.
2.2. HPLC analýza extraktu A. lappa
A. lappa sa extrahoval s použitím refluxného zariadenia (destilovaná voda, 3 hodiny pri 100 °C). Extrahovaný roztok sa prefiltroval a zahustil pomocou nízkotlakovej odparky. Extrakt z A. lappa mal výťažok 44,69 % po lyofilizácii pri -80 °C. Chromatografická analýza A. lappa sa uskutočnila pomocou HPLC spojenej s použitím systému 1260 InfinityⅡ HPLC (Agilent, Pal Alto, CA, USA). Na chromatickú separáciu sa použila kolóna EclipseXDB C18 (4,6 x 250 mm, 5 um, Agilent) pri 35 °C. Celkovo 100 mg vzorky sa zriedilo v 10 ml 50 % metanolu a sonikovalo sa 10 minút. Vzorky sa prefiltrovali pomocou injekčného filtra (Waters Corp., Milford, MA, USA) 0,45 um. Zloženie mobilnej fázy bolo 0,1% kyselina fosforečná (A) a acetonitril (B) a kolóna bola eluovaná nasledovne: 0-60 min, 0%; 60 – 65 min, 100 %; 65 – 67 min, 100 %; 67–72 minút, 0 % rozpúšťadla B s prietokom 1,0 ml/min. Výtok bol pozorovaný pri 210 nm s použitím vstrekovacieho objemu 10 ul. Analýza sa uskutočnila trojmo.
2.3. Ustajnenie a manažment zvierat
Samce potkanov Sprague-Dawley (SD) vo veku 5 týždňov a samce myší ICR vo veku 6 týždňov boli zakúpené od Samtako Bio Korea (Gyeonggi-do, Kórea). Zvieratá boli držané v miestnosti s použitím konštantnej teploty (22 ± 2 °C) a vlhkosti (55 ± 10 %) a cyklu svetlo/tma 12/12 h. Zvieratá boli oboznámené so stavom viac ako týždeň pred začatím experimentu. Zvieratá mali ad libitum prísun krmiva a vody. Súčasné etické pravidlá pre starostlivosť o zvieratá a manipuláciu so zvieratami na Gachonskej univerzite (GIACUC-R2019003) boli prísne dodržiavané pri všetkých experimentálnych postupoch na zvieratách. Štúdia bola navrhnutá ako zaslepená a paralelná štúdia. Postupovali sme metódou eutanázie podľa smerníc Etického výboru pre pokusy na zvieratách.
2.4. Injekcia a liečba MIA
Potkany boli náhodne rozdelené do 4 skupín, menovite simulované, kontrolné, indometacín a A. lappa. Po anestetizácii 2% zmesou izofluoránu O2 sa potkanom intraartikulárne do kolenných kĺbov vstreklo 50 ul MIA (40 mg/m; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), čo viedlo k experimentálnej OA. Ošetrenia sa uskutočňovali ako je uvedené nižšie: kontrolné a simulované skupiny sa udržiavali iba so základnou stravou AIN-93G. Len skupine s indometacínom bol podávaný indometacín (3 mg/kg) začlenený do stravy AIN-93G a skupine s A. lappa 300 mg/kg bola pridelená diéta AIN-93G doplnená o A. lappa (300 mg/kg). V liečbe sa pokračovalo 24 dní odo dňa indukcie OA rýchlosťou 15–17 g na 190–210 g telesnej hmotnosti na dennej báze.
2.5. Meranie hmotnosti
Po indukcii OA sa uskutočnilo meranie nosnosti zadných končatín potkanov pomocou prístroja Incapacitance-MeterTester600 (IITC Life Science, Woodland Hills, CA, USA) podľa plánu. Vypočítalo sa rozloženie hmotnosti na zadných končatinách: nosnosť hmotnosti (%)
